Джеймс Марстерс родился 20 августа 1962 года в городе Гринвилль (Калифорния, США). Джеймс вместе с братом и сестрой вырос в калифорнийском городе Модесто. Ещё в детстве учась в четвертом классе решил стать актёром, сыграв роль в школьной постановке Винни Пуха. После этого он вступил в школьную театральную группу и много играл в различных пьесах и мюзиклах. После окончания школы в 1980 году Джеймс два года учился на курсах актёрского мастерства в Тихоокеанской консерватории актёрского мастерства и Американской театральной консерватории.
Любит сам исполнять каскадёрские трюки. Левша. Был женат на Liane Davidson, развёлся, есть сын Салливан (Sullivan).

Карьера:

В 1987 году Марстерс переехал в Чикаго. Первой серьёзной ролью в театре для него стала роль Фердинанда в театре. За исполнение роли Робеспьера в 1989 году Марстерс был номинирован на премию Joseph Jefferson Award.
В 1990 году Марстерс вместе с Лиан Дэвидсон переехал в Сиэтл, где основал собственную труппу и много играл на сцене.
Зарабатывал на жизнь пением под гитару в ночном клубе в Санта-Монике.
В 1997 году Марстерса пригласили на роль Спайка во втором сезоне сериала «Баффи — истребительница вампиров». Поначалу предполагалось, что персонаж Спайка будет участвовать в сериале несколько серий, но зрителям он понравился и его сделали постоянным героем сериала. К последним сезонам его роль стала одной из основных в сериале, а после окончания съёмок в 2003 году режиссёр Джосс Уэдон пригласил Джеймса продолжать играть Спайка в спин-офф «Ангел».
Кроме ролей в «Баффи — истребительница вампиров» и «Ангел» Марстерс снимался в телесериалах «Тысячелетие», «Тайны Смолвилля», «Без следа», где играл эпизодические роли.
В течение двух лет (с 2003 года до весны 2004 года) был фронтменом рок-группы Ghost of the Robot. Дебютный альбом группы Mad Brilliant вышел 2 февраля 2003 года. Далее последовал выпуск трёх синглов («Valerie», «David Letterman» and «New Man») и концертный тур по Европе.
Последние работы в кино — небольшая роль в экранизации романа ирландской писательницы Сесилии Ахерн «P.S. Я люблю тебя». В настоящее время участвует в съёмках фильма — экранизации манги Акиры Ториямы Dragonball. Марстерс играет роль злодея Пикколо. Фильм выйдет на экраны 15 августа 2008 года.

2000: 
— номинация на премию «Сатурн» (приз Академии научной фантастики, фэнтези и фильмов ужасов США) в категории «Лучший    телеактёр второго плана» за роль Спайка в телесериале «Баффи — истребительница вампиров»
— премия Teen Choice Awards в категории «выбор теледруга»
2001:
— премия «Сатурн» в категории «Лучший телеактёр второго плана» (Спайк, «Баффи — истребительница вампиров»)
2002:
— премия «Cinescape Genre Face of the Future Award» (Лицо будущего поколения)
2003:
— номинация на премию «Сатурн» в категории «Лучший телеактёр второго плана» (Спайк, «Баффи — истребительница вампиров»)
— номинация на премию «Золотой спутник» в категории «Лучшее исполнение актером роли второго плана в сериале»
2004:
— премия «Сатурн» в категории «Лучший телеактёр второго плана» (Спайк, «Баффи — истребительница вампиров» и «Ангел»)

Северная сторона / Northern Exposure (1992-1993) - Bellhop (эпизод «It Happened in Juneau»)
                                                                       - Reverend Harding («Grosse Pointe 48230»)
Medicine Ball (1995) - Mickey Collins ("Heart and Sole")
Moloney (1997) - Billy O'Hara ("Herniated Nick")
Баффи — истребительница вампиров / Buffy the Vampire Slayer (1997-2003) - Spike (96 эп.)
Ангел / Angel (1999-2004) - Spike (24 эп.)
Тысячелетие / Millennium (1999) - Eric Swan («Collateral Damage»)
The Enforcers (2001) - Charles Haysbert
Strange Frequency (2001) - Mitch Brand ("Soul Man")
Андромеда / Andromeda (2001) - Charlemagne Bolivar ("Into the Labyrinth")
Spider-Man: The New Animated Series (2003) - Sergei (озвучка; 2 эп.)
The Mountain (2004) - Ted Tunney  ("A Piece of the Rock")
Тайны Смолвилля / Smallville (2005-2007) - Professor Milton Fine / Brainiac / Brainiac 5 (13 эп.)
Without a Trace (2007-2008) - Det. Grant Mars ("Lost Boy", "Clean Up", "One Wrong Move", "Article 32")
Saving Grace (2007) - Dudley Payne ("Bring It On, Earl")
Torchwood  (2008) - Captain John Hart («Kiss Kiss, Bang Bang»,"Fragments", "Exit Wounds")
The Capture of the Green River Killer (2008) - Ted Bundy
Star Wars: The Clone Wars (2008) - Captain Argyus ("Cloak of Darkness")
Numb3rs (2009) - Damien Lake ("Guilt Trip")
The Super Hero Squad Show (2009) - Mister Fantastic (озвучка; 5 эп.)
Lie to Me (2009) -Pollack ("Truth or Consequences")
Caprica (2010) - Barnabas Greeley ("Know Thy Enemy", "End of Line", "Unvanquished","Retribution")
Hawaii Five–0 (2010-2011) - Victor Hesse ("Pilot", "Hana 'a'a Makehewa", "Ha'i'ole")
Supernatural (2011) - Donald Stark ("Shut Up, Dr. Phil")
Three Inches (2011) - Troy Hamilton ("Pilot")
Metal Hurlant Chronicles (2012) - Brad

Дом ночных призраков / House on Haunted Hill (1999) - телеоператор Channel 3
Извилистая дорога / Winding Roads  (1999) - Billy Johnson
Шанс / Chance  (2002) - Simon
Cool Money (2005) - Bobby Comfort
Марионетки теней / Shadow Puppets (2007) - Jack
Superman: Doomsday (2007) - Lex Luthor (озвучка)
P.S. Я люблю тебя / P.S. I Love You  (2007) - John McCarthy
Жемчуг дракона / Dragonball Evolution (2008) - Lord Piccolo
Moonshot: The Flight of Apollo 11 (2009) - Buzz Aldrin
High Plains Invaders (2009) - Sam Denville
Dragon Warriors (2012) - Lord Tensley

"Почему" - актер.
"Буря" (У. Шекспир) - Себастьян /Фердинанд.
"Макбет" (У. Шекспир) - Макбет.
"Двенадцатая ночь" - Эндрю Агуйчик.
"Кукольный домик" - Торвальд.
"Голоса во тьме" - деревенский неудачник.
"Убийцы" - транжира.
"Экспромт в Огайо".
"Вокзал Виктория" - водитель такси.
"Шаль" - ученик.
"Преступники в любви" - режиссер.
"Жизнь это сон" - режиссер / Сигизмундо.
"Совершенство встречается на каждом шагу" (Кристофер Фрай) - директор / Тегис.
"Нечто невыразимое" - директор.
"Неподкупный" (Кристофер Картмилл) - Максимилиан Де Робеспьер.
"Быть друзьями" (Рональд Холмен) - артист.
"Потеря' (Рональд Холмен) - офицер флота.
"Смертельный риск" (Рон Марк) - Тод Кемп.
"Белая чума"
"Женитьба Фигаро" - Педрилль.